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Caracterización de la enzima superóxido dismutasa tipo cobre-zinc de la levadura marina Debaryomyces hansenii, y clonación de la secuencia que lo codifica a partir de ADNc.
Characterization of the superoxide dismutase enzyme type copper-zinc from the marine yeast Debaryomyces hansenii, and cloning of the encoding sequence from cDNA.
NORMA YOLANDA HERNANDEZ SAAVEDRA
JOSE LUIS OCHOA OCHOA
Acceso Abierto
Atribución-NoComercial-SinDerivadas
enzima superóxida dismutasa; Debaryomyces hansenii, clonación
superoxide dismutase enzyme, Debaryomyces hansenii, cloning
"La superóxido dismutasa tipo cobre-zinc (SOD-1), es una enzima ubicua que se encuentra en todos los organismos eucariontes, y tiene varios efectos importantes en los organismos aerobios. Esta enzima ha sido ampliamente estudiada en varias especies de organismos tanto eucariontes como no-eucariontes. Sin embargo, de hongos y levaduras únicamente la SOD-1 de Saccharomyces cerevisiae ha sido estudiada extensivamente, a pesar de que en los bancos de datos se encuentran registradas las secuencias del gen sod-1 de Schizosaccharomyces pombe, Neurospora crassa y Aspergillus japonicus. En el laboratorio, hemos aislado la forma citosólica de la Cu,Zn SOD de Debaryomyces hansenii, observándose una masa molecular de 15.6 kDa para cada subunidad. La preparación de la enzima mostró ser heterogénea mediante cromatografía IMAC, electroforesis nativa e isoelectroenfoque (con dos intervalos de pI: 5.14 a 4.0 y 1.8 a 1.6), sugiriendo la existencia de dos formas de Cu,Zn SOD en Deb. hansenii. Otras observaciones que apoyan lo anterior, son las diferencias encontradas tanto en composición de aminoácidos como actividad específica de dos fracciones derivadas de la cromatografía IMAC (fracciones 32 y 37). Las diferencias principales radican en el número de residuos de histidinas y tirosinas: la forma uno (IMAC 32, ~17 300 U/mg de proteína) contiene 6 residuos de histidina, mientras la forma dos (IMAC 37, ~8 000 U/mg de proteína) solo presenta 3 residuos de histidina. En el caso de los residuos de tirosina, la forma uno contiene dos, mientras que la forma dos el número se incrementa a 5. Estos resultados sugieren que los tres nuevos residuos de tirosina de la forma dos podrían estar jugando el papel de las histidinas faltantes en el sitio activo. Mediante diferencias de expresión de las proteínas, observadas bajo condiciones de estrés provocadas por la concentración de CIO2, sugerimos la presencia de dos genes. La preparación de la enzima mostró gran estabilidad entre pH 6 y 7, sobreviviendo periodos de ebullición de 10 minutos sin perder más del 60% de la actividad. Mediante análisis con anticuerpos de conejo (Western blot), observamos que las enzimas son fuertemente reconocidas por su suero homólogo, mientras que con sueros generados contra Cu,Zn SOD de Sacch. cerevisiae y de Bos taurus (bovino) solo se observan reacciones de reconocimiento débiles..."
"Copper-Zinc superoxide dismutase (SOD-1) is an ubiquitously occurring eukaryotic enzyme with a variety of important effects on respiring organisms. This enzyme has been studied on several species of eukaryotic and non-eukaryotic organisms. However, the Cu,Zn SOD from molds and yeast have not been studied extensively. Today, the only fungí specie from which the SOD-1 has been characterized is Saccharomyces cerevisiae, although the nucleotide sequences of sod-1 gene from Schizosaccharomyces pombe, Neurospora crassa and Aspergillus japonicus, are included on data banks. We have isolated a cytosolic Cu,Zn SOD from Debaryomyces hansenii showing a subunit mass of 15.6 kDa. The preparation was found to be heterogeneous by IMAC chromatography, native-and IF-electrophoresis (showing two pI ranges: 5.14 to 4.0 and 1.6 to 1.8), suggesting the existence of two Cu,Zn SOD enzymes in Deb. hansenii. Differences on specific activity and amino acid composition of two Cu,Zn SOD IMAC fractions (32 and 37) supports this conclusion. Major differences are observed on the number of histidine and tyrosine residues; one form (IMAC 32, ~17 300 U/mg of protein) presents 6 histidines, while the other (IMAC 37, ~8 000 U/mg of protein) only 3 residues; the number of tyrosine residues on form one are 2 while on form two is increased to 5. We suggest that the 3 tyrosine residues could be play the role of the histidines on the active site of form one. Under stress conditions promoted by CI02 concentration, the presence of two genes could be suggested. The enzyme preparation had a remarkably strong stability at pH 6.0 to 7.0, surviving boiling periods of 10 minutes without losing more than 60 % of activity. On Western blots these enzymes were recognized by antibodies raised in rabbits against Deb. hansenii extracts, while only a weak cross-reaction was detected using antibodies generated against either Sacch. cerevisiae and/or bovine erythrocyte Cu,Zn SODs..."
Centro de Investigaciones Biológicas del Noroeste, S.C.
1997-11
Tesis de doctorado
Español
ENZIMOLOGIA
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