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Clonación, secuenciación y mapeo cromosómico de las dos formas de la enzima superóxido dismutasa tipo CuZn (Cu,ZnSOD) de la levadura marina Debaryomyces hansenii
Delia Irene Rojas Posadas
NORMA YOLANDA HERNANDEZ SAAVEDRA
Acceso Abierto
Atribución-NoComercial-SinDerivadas
SOD, Debaryomyces hansenii, Cu, ZnSOD
"La superóxido dismutasa (SOD) es una enzima que comunmente se encuentra en los organismos aeróbicos, y juega una papel central en el metabolismo de los radicales libres y las especies reactivas de oxígeno. La levadura marina Debaryomyces hansenii cepa C11 presenta tres isoformas de la enzima cobre-zinc SOD (dos homodímeros y un heterodímero). En un estudio previo, Hernández-Saavedra clonó la secuencia codificante de una de las dos formas básicas de la Cu,ZnSOD (SODC), denominada dh sod1. En el presente trabajo se clono y secuencio la dh sod2 de la levadura marina D. hansenii. Se realizó un screening en una librería genómica para buscar la región promotora y se mapearon ambas formas dh sod1 y dh sod2 utilizando ADN intacto para separar los cromosomas mediante electroforésis de campo pulsante. El uso de primers degenerados, diseñados a partir de péptidos internos obtenidos mediante digestión con tripsina de la proteína purificada, permitió obtener fragmentos de ~420 pares de bases (pb) después de la amplificación mediante la reacción en cadena de la polimerasa. El análisis de la secuencia mostró un 97% de homología con la SODC de S. cerevisiae y sólo un 69% de homología con la dh sod1 de D. hansenii. Un resultado similar fue obtenido al construir un árbol de homología con secuencias de levaduras marinas y terrestres reportadas en el Centro Nacional de Información en Biotecnología (NCBI). Se obtuvieron dos grandes grupos, uno que incluye levaduras terrestres y otro que incluye levaduras marinas. Sin embargo en el árbol de homología, la dh sod2 se incluyo en el grupo de las levaduras terrestres. Del screening de la librería genómica se obtuvieron varias clonas positivas, dos de las cuales fueron secuenciadas (una de 656 pb y otra de 660 pb), una de ellas con homología a secuencias del cromosoma VII de S. cerevisiae, sin embargo, no fue posible obtener la secuencia correspondiente a la dh sod del promotor. Se logró separar el ADN intacto de D. hansenii mediante electroforésis de campo pulsante, obteniendo un patrón difuso de pequeños cromosomas. Sin embargo, cuando se uso con la dh sod2 marcada con digoxigenina en la hibridación, se logró obtener una banda bien definida. Esto, aunado a los reportes de expresión diferencial de ambas formas (Dh SODC1 y Dh SODC2) bajo condiciones de estrés dado por compuestos clorados o metales sugieren el probable origen génico (no formas alélicas)..."
"Superoxide dismutase (SOD) is an enzyme that is common in aerobic organisms and plays a central role in the metabolic control of free radicals and reactive oxygen species. The marine yeast Debaryomyces hansenii strain C 11 presents three forms of the copper-zinc SOD enzyme (two homodimers and one heterodimer). In previous work, Hernández-Saavedra cloned one of the encoding sequences of one of the two basic forms of Cu,ZnSOD (SODC), designated dh sod1. In this study, the dh sod2 was cloned and sequenced, a screening of a genomic library was done looking for the promoter sequence and mapping both forms (dh sod1 and dh sod2) on intact DNA separated by pulsed field gel electrophoresis. The use of degenerate oligonucleotides, designed from internal peptides obtained by trypsin digestion of the pure protein, yielded a 420 bp fragment after amplification by the polymerase chain reaction. The sequence analysis of showed 97% homology of the dh sod2 of D. Hansen with SODC of Saccharomyces cerevisiae, while only a 69% homology was found with the dh sod1. A similar result was obtained when a homology tree was constructed, considering the corresponding sequences of marine and terrestrial sequences reported in the National Center of Biotechnology Information. Two main groups were obtained; one included terrestrial yeast, while the other included marine yeast. However, on the homology tree, the dh sod2 was included in the group of terrestrial yeast. From the screening of the genomic library, several positive clones were obtained, two of which were sequenced (656 and 660 bp), resulting in one with the homology to fragments of chromosome VII of S. cerevisiae. However, it was not possible to find the sequence corresponding to the dh sod promoter. Intact DNA of D. hansenii was separated by pulsed field gel electrophoresis, resulting in a diffused patter of small chromosomes. However, when a probe of digoxigenine-labeled dh sod2 was used for hybridization, a single well-defined band was obtained. This, together with reports of differential expression of both forms of the enzyme (Dh SODC1 and Dh SODC2) under metal- or chloride-based substances, supports the genomic origin of both sequences (not allelic forms). The presence and function of both genes in the marine yeast probably are the result of the marine and terrestrial environmental adaptations of D. hansenii."
Centro de Investigaciones Biológicas del Noroeste, S.C.
2003-04
Tesis de maestría
Español
ENZIMOLOGIA
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Appears in Collections:Tesis de Maestría en Ciencias en Uso, Manejo y Preservación de los Recursos Naturales

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