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http://cibnor.repositorioinstitucional.mx/jspui/handle/1001/497| Aislamiento, clonación y secuenciación de genes que codifican para inhibidores kazal en el camarón blanco (Penaeus vannamei) | |
| JULIO ANTONIO HERNÁNDEZ GONZÁLEZ | |
| MARTHA PATRICIA HERNANDEZ CORTES | |
| Acceso Abierto | |
| Atribución-NoComercial-SinDerivadas | |
| Inhibidores kazal, hepatopáncreas, Penaeus vannamei, RT-PCR kazal inhibitors | |
| "Los inhibidores Kazal se distinguen por sus relaciones topográficas entre los enlaces disulfuro, la localización del sitio reactivo y que pueden ser de uno o más dominios. Esta familia de inhibidores controla la acción de enzimas serin proteinasas y está involucrada en diversas funciones como la digestión, defensa y acción anticoagulante. El objetivo general de este trabajo fue obtener secuencias que codificaran para inhibidores Kazal en hepatopáncreas de Penaeus vannamei. Se realizó RT-PCR con oligonucleótidos diseñados en base a la secuencia de un inhibidor multidominio de P. monodon y usando como templado el RNA del hepatopáncreas de P. vannamei. Para obtener los extremos se amplificó usando como templado una librería unidireccional de ADNc de hepatopáncreas. El RT-PCR derivó en un fragmento de 223 pb (fragmento A), mientras que las amplificaciones a partir de la librería resultó en tres fragmentos de 256, 222 y 129 pb (fragmento B, C y D). El fragmento A traduce 74 aminoácidos que corresponden a dos dominios parciales de un inhibidor Kazal. El primer dominio posee de la tercera cisteína a la sexta y el segundo dominio de la primera cisteína a la quinta. Se identificó el sitio reactivo a alanina, por lo cual indica especificidad a elastasa. En el fragmento B, 174 pb no son traducibles y contienen codón de terminación, una señal de poliadenilación 12 pb río arriba de la poli (A) que consta 15 pb. El fragmento C codifica desde una parte no traducible que incluye el codón de inicio; el fragmento C y B empalman dando la secuencia completa de un inhibidor con un solo dominio, el cual contiene glicina en el sitio reactivo pudiendo tener una especificidad hacia la enzima elastasa. La mayor homología de la secuencia deducida de los fragmentos C y B fueron con un inhibidor Kazal de anémona que tiene especificidad sobre elastasa. El fragmento D de 129 pb empalma con los fragmentos B y C sin embargo, presenta un salto de 93 pb. El análisis de su secuencia deducida corresponde a una proteína diferente a los inhibidores, que si bien tiene similitudes porque la distribución de las cisteínas es similar a los inhibidores tipo Kazal, no presenta todas las características que la podrían definir como tal. La capacidad de inhibir de los inhibidores encontrados deberá ser confirmada con el aislamiento de la proteína y estudios de cinéticas, ya que no todos los dominios son funcionales..." Kazal inhibitors are characterized by topographic relationships between their disulfide bonds, the reactive side location, and their mono- or multi-domain. This inhibitor family controls the enzyme action of serine proteinases and is involved in functions, such as digestion, defense, and coagulation. The objective of this work was to obtain the sequences that codified Kazal inhibitors in the Penaeus vannamei migdut gland. An RT-PCR was run with oligonucleotides designed from a multi-domain Kazal inhibitor from P. monodon and midgut gland RNA as template. To obtain both end extremes, a template from a digestive gland cDNA library was used. A 223-bp fragment (A) was obtained from the RT-PCR, and three fragments (B, C, D,) of 256, 222, and 129 bp were obtained from the library. Fragment A translates to 74 amino acids that correlate with two partial domains of a Kazal inhibitor. The first domain is located from the third to sixth cystein, and the second domain, from the first to the fifth cystein. The reactive site was alanine, which indicates specificity for elastase. In fragment B, 174 bp was not translated, the fragment is characterized by a terminal codon, a signal sequence twelve bp upstream from poly A. Fragment C contains an initial codon and matches fragment B. Both fragments are considered a full sequence corresponding to a mono-domain with glycine at the reactive side, indicating that this Kazal inhibitor has elastase as their target enzyme. The best similarity was found with an anemone Kazal inhibitor that is specific to elastase. Fragment D, matched the B and C fragments, but a gap of 93 bp was present. The deduced sequence shows that this is a different protein. The inhibition capability has to be confirmed with protein isolation and kinetics studies because not all domains are functional. The shrimp inhibitors belong to a non-classic group, but are particular because the amino acid number exposed to the enzyme is different. Therefore, it is necessary to obtain the three dimensional configuration to establish the structure-function relation and determine their physiological role. | |
| Centro de Investigaciones Biológicas del Noroeste, S.C. | |
| 2003-09 | |
| Tesis de maestría | |
| Español | |
| ENZIMOLOGIA | |
| Versión aceptada | |
| acceptedVersion - Versión aceptada | |
| Aparece en las colecciones: | Tesis de Maestría en Ciencias en Uso, Manejo y Preservación de los Recursos Naturales |
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| hernandez_j.pdf | Tesis de Julio Antonio Hernández González | 913.68 kB | Adobe PDF | Visualizar/Abrir |