Please use this identifier to cite or link to this item: http://cibnor.repositorioinstitucional.mx/jspui/handle/1001/439
Construcción de una cepa de levadura productora de dsRNA específico contra el virus de la mancha blanca en camarón Litopenaeus vannamei
ANA RUTH ALVAREZ SANCHEZ
CLAUDIO HUMBERTO MEJIA RUIZ
Acceso Abierto
Atribución-NoComercial-SinDerivadas
camaron; digestibilidad; RNAi; WSSV; Yarrowia lipolytica
Actualmente el síndrome del virus de la mancha blanca (WSSV) es, hasta el momento, la enfermedad más devastadora para el camarón de cultivo, causando mortalidades de hasta un 100% en un corto periodo de tiempo. Una potencial herramienta biotecnológica contra patógenos virales, es el RNA de interferencia (RNAi) mecanismo celular que es inducido por dsRNA. Actualmente, la producción del dsRNA in vitro es costosa e impráctica, por lo que, una alternativa es la producción de dsRNA en sistemas biológicos. El uso de levaduras como Yarrowia lipolytica confiere ventajas aprovechables para la producción del dsRNA. El objetivo de este trabajo fue generar una cepa de levadura productora de dsRNA específico contra WSSV y evaluar su actividad antiviral en el camarón Litopenaeus vannamei. Asimismo, se analizó in vitro la digestibilidad de la levadura Y. lipolytica y del dsRNA específico en el tracto digestivo del camarón con el fin de determinar si la pared celular es degradada para que esta levadura sea considerada como vehículo portador de dsRNA. Una construcción dsRNA-ORF89 en el plásmido pJC410 fue subclonada en el plásmido de expresión pRRQ-1 de Y. lipolytica resultando la cepa P01-AS. La producción de dsRNA-OFR89 se determinó por RT-PCR y qRT-PCR. Con el fin de aumentar la producción de dsRNA-ORF89 en P01-AS, se realizaron diferentes pruebas de shock térmico, cambios de pH y concentraciones de sales en diferentes medios. Además, se mutagenizó el gen Rnt1 de Y. lipolytica. La actividad antiviral del dsRNA-ORF89 se evaluó mediante un bioensayo reto. Se obtuvo una producción de 182 ng de dsRNA-ORF89 por litro a las 32 horas de cultivo celular de la cepa de levadura P01-AS. La expresión del gen Rnt1 fue mayor en medio de cultivo YPD, y menor en medio mínimo YNB, sin embargo, su producción se correlaciona con la densidad celular, observando una mayor expresión en medios con agua de mar. Para la mutación del gen Rnt1 con el casete de interrupción URA::Rnt1, no se observó crecimiento conspicuo de colonias, lo que sugiere que la mutación es letal. El bioensayo reto en camarones inoculados con WSSV y tratados con ARN total proveniente de la cepa P01-AS produjo una mortalidad acumulada del 75%, menor a la del control sin tratamiento (100%). Los análisis in vitro de digestibilidad indicaron que las enzimas de la glándula digestiva de camarón digieren las células de Y. lipolytica e hidrolizan el dsRNA-ORF89 a partir de los 30 min. [...]
The white spot syndrome virus (WSSV) is, until now, the most devastating disease for the cultivation of shrimp, causing mortalities of up to 100 % in a short period. A potential biotechnological tool against pathogenic viral is the RNA of interference (RNAi) mechanism that is induced by dsRNA. The in vitro production of the dsRNA is costly. An alternative is the dsRNA production in biological systems. The use of yeasts as Yarrowia lipolytica awards usable advantages for the production of the dsRNA. The objective of this study was to generate a strain of yeast producer of specific dsRNA against WSSV and to evaluate its antiviral activity in the shrimp Litopenaeus vannamei. The in vitro digestibility of the yeast Yarrowia lipolytica and of the specific dsRNA in the digestive tract of shrimp was essayed aiming to determine if the cell wall is degraded and to evaluate this yeast as carrier of dsRNA against WSSV. A construction of dsRNA-ORF89 in the plasmid pJC410 was sub cloned in the expression plasmid pRRQ-1 of Yarrowia lipolytica, resulting in the strain P01-AS. The production of dsRNA-ORF89 were determinate by RT-PCR y qRT-PCR. In order to increase the production of dsRNA-ORF89 in the strain P01-AS, were experimented with thermal shock, change in the pH and salt concentrations in different media. We also mutated the gene Rnt1 of Yarrowia lipolytica. The antiviral activity of dsRNA-ORF89 was tested in a challenge bioassay. A production of dsRNA-ORF89 of 182 ng was obtained by liter (8.9x10-6) after 32 hours of cellular cultivation of the yeast P01-AS strain. The expression of the RNAsa III was major in the medium YPD, and minor in the medium YNB. Nevertheless, its production is correlated to cellular density, observing a major expression in media containing seawater. For the mutation of the gene Rnt1, it was observed that in all the mutation events with the cassette of interruption URA::Rnt1, it did not observe conspicuous colonies growth suggesting that the mutation is lethal. The challenge bioassay in shrimp inoculated with WSSV and traded total RNA from strain P01-AS obtaining a cumulative mortality of 75 %, with regard to the control group without treatment (100 %). The digestibility tests in vitro found that enzymes from the digestive gland shrimp digest the cells of Y. lipolytica and hydrolyze dsRNA-ORF89 after 30 minutes [...]
Centro de Investigaciones Biológicas del Noroeste, S.C.
14-03-2017
Tesis de doctorado
Español
FORMACIÓN DE ANTICUERPOS
Versión publicada
publishedVersion - Versión publicada
Appears in Collections:Tesis de Doctorado en Ciencias en el Uso, Manejo y Preservación de los Recursos Naturales

Upload archives


File Description SizeFormat 
alvarez_a.pdfTesis de Ana Ruth Álvarez Sánchez3.91 MBAdobe PDFView/Open