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http://cibnor.repositorioinstitucional.mx/jspui/handle/1001/2642| MICROINYECCIÓN COMO METODOLOGÍA DE ENTREGA DE MATERIAL DE EDICIÓN A TRAVÉS DE CRISPR/CAS9 EN PENAEUS VANNAMEI | |
| Daniela Marianne Marín Carrasco | |
| Ana María Ibarra Humphries Raúl Antonio Llera Herrera | |
| Acceso Abierto | |
| Atribución-NoComercial-SinDerivadas | |
| Hox, CRISPR/Cas9, DSB repair, microinyección, mutación microinjection, mutation | |
| "Las nuevas herramientas de uso biotecnológico e ingeniería genética como CRISPR/Cas9, son consideradas técnicas revolucionarias que podrían permitir potencializar la mejora genética sostenible de la acuicultura. CRISPR /Cas9 se describe como la acción de una nucleasa (Cas9) guiada por fragmentos cortos de ARN con complementariedad de bases al genoma y como consecuencia, un rompimiento de doble cadena que tendrá que ser reparado. Si bien, CRISPR/Cas9 es una poderosa herramienta de edición genética, esta depende de algunos factores como una entrega exitosa dentro de la célula o embrión, o el tipo de reparación del ADN activado, Non-Homologous End Joining (NHEJ) o Homology-Directed Repair (HDR).
El propósito de este trabajo es la implementación de las nuevas tecnologías CRISPR/Cas9 en el crustáceo decápodo Penaeus vannamei, a partir del uso de la microinyección embrionaria como la técnica de acarreo de material de edición. Para la estandarización de esta metodología se evaluaron métodos de reblandecimiento de la pared del huevo, sujeción óptima de los huevos a un sustrato y por último, el diseño óptimo de la aguja para la microinyección, observando con este método supervivencias aproximadas de 3 - 5%. A partir de una co-inyección de sondas donadoras para genes involucrados en el desarrollo de apéndices (Ubx) se observaron algunos fenotipos con malformaciones esperadas por disrupción de dicho gen. Para la verificación genética de las mutaciones resultantes se evaluaron metodologías de enriquecimiento genómico y extracciones de ADN enzimáticas ante el obstáculo que supone las extracciones de los diminutos nauplios individuales.
Finalmente, se esperaba que el diseño realizado para las sondas donadoras utilizadas en el sistema CRISPR/Cas9 (ssODN y dsODN), permitiría validar una metodología sencilla para la caracterización del genotipo obtenido mediante la amplificación por PCR a partir de la combinación estratégica de oligonucleótidos y a su vez la determinación del mecanismo de reparación de ADN activado por la célula (NHEJ o HDR). Sin embargo, los resultados arrojan un conjunto de amplicones inespecíficos generados posiblemente a partir del uso de secuencias altamente repetitivas, lo que aunado a la secuenciación lleva a que no es posible concluir sobre la generación de mutaciones. Se propone el uso de secuenciación masiva (NGS) a futuro para verificar las mutaciones generadas."
"The new biotechnological tools and genetic engineering such as CRISPR/Cas9 are now considered revolutionary techniques that can potentiate the sustainable genetic improvement of aquaculture species. CRISPR/Cas9 is described as a nuclease (Cas9) guided by a short RNA capable of base pairing to the genome, leading to a double strand break that will have to be repaired. While CRISPR/Cas9 is a powerful gene editing tool, it depends on some factors such as a successful delivery within the cell or embryo, or the type of DNA repair mechanism activated. Non-Homologous End Joining (NHEJ) or Homology- Directed Repair (HDR). The objective of this work was to apply the new CRISPR / Cas9 technologies in the decapod crustacean Penaeus vannamei, evaluating the use of microinjection as the technique of carrying editing material into an embryo. For the standardization of this methodology, methods of softening the egg wall, optimal attachment of the eggs to a substrate and last, the optimal design of the needle for microinjection were thoroughly evaluated. With this protocol, we observed improvement of survival rates up to 3-5%. From a co-injection of donor probes for genes involved in appendage development (Ubx), phenotypes with expected abnormal development were observed, implying successful disruption of the gene. For the genetic verification of the resulting mutations, genomic enrichment methodologies and enzymatic DNA extractions were evaluated to deal with the difficulty of extractions from the tiny individual nauplii. Finally, it was hypothesized that the unique design of the donor probes for the CRISPR/Cas9 system (ssODN and dsODN), would allow for the validation of a simple methodology for the characterization of the obtained genotype by PCR amplification using a strategic combination of oligonucleotides, and simultaneously for establishing which cell DNA repair mechanism (NHEJ or HDR) was activated. Nonetheless the results showed a set of nonspecific amplicons most probably generated from the use of highly repetitive sequences, which coupled with Sanger limited sequencing, did not allow to conclude about the generation of mutations by CRISPR/Cas9. Using massive sequencing as that from NGS is proposed for verifying mutations in future work." | |
| Centro de Investigaciones Biológicas del Noroeste, S.C. | |
| 2021 | |
| Tesis de maestría | |
| Español | |
| INGENIERÍA GENÉTICA | |
| Versión aceptada | |
| acceptedVersion - Versión aceptada | |
| Aparece en las colecciones: | Tesis de Maestría en Ciencias en Uso, Manejo y Preservación de los Recursos Naturales |
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| marín_d TESIS.pdf | Tesis de Daniela Marianne Marín Carrasco | 3.5 MB | Adobe PDF | Visualizar/Abrir |