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Actividad y expresión de aspártico proteasas en el desarrollo larvario del camarón blanco Litopenaeus vannamei
ROGELIO FRANCISCO ROMERO HERNANDEZ
Fernando Luis García Carreño
Liliana Carolina Rojo Arreola
Acceso Abierto
Atribución-NoComercial-SinDerivadas
Catepsina D, β-secretasa, desarrollo larval, camarón, RNAi
Cathepsin D, β-secretase, larval development, shrimp
"El camarón blanco (Litopenaeus vannamei), es un crustáceo que durante su desarrollo larval pasa a través de cambios morfológicos, ecológicos y fisiológicos que se encuentran asociados con la maduración de la capacidad motora y metabólica. En otros artrópodos, se ha identificado que la actividad enzimática presenta variaciones relacionadas con los eventos de metamorfosis. Las enzimas sobre la cuales se centra esta investigación son las proteasas, que regulan procesos celulares importantes y mantienen la homeostasis celular. En particular, esta investigación se enfoca en la descripción del perfil de actividad y expresión genética de las aspártico proteasas, β-secretasa y catepsina D, en el desarrollo ontogénico de L. vannamei. Se obtuvieron muestras de 18 estadios larvales a partir de las cuales se extrajeron las proteínas solubles totales y el RNA total usando técnicas estándar. La actividad proteolítica se cuantificó usando sustratos fluorogénicos específicos para aspártico proteasas, la cual fue verificada con ensayos en presencia del inhibidor Pepstatin-A, específico para estas enzimas. Los estadios nauplio presentaron la mayor actividad de catepsina D, mientras que para β-secretasa un pico de actividad se detectó en el estadio nauplio 3. Los resultados de la cuantificación de los transcritos de catepsina D mostraron que el transcrito se encuentra en todos los estadios con una mayor expresión en los estadios nauplio 5, mysis 2 y 3, por otro lado, β-secretasa se expresa en mucho menor cantidad pero de manera constante, a lo largo del desarrollo larvario solo se detectó diferencia significativa en el estadio postlarva 11. Para tratar de determinar la relevancia de estas enzimas en el desarrollo larval, se utilizó RNAi para silenciar los transcritos de interés, 15 μg/mL de dsRNA de cada transcrito fue suministrado directamente al agua donde fueron mantenidas las larvas, el efecto del RNAi se evaluó mediante observación directa de cambios en la morfología y comportamiento de las larvas y por qPCR. Los especímenes no mostraron diferencias en la sobrevivencia ni en el comportamiento, las cuantificaciones de los transcritos correspondientes a los tratamientos no mostraron diferencias significativas con los controles, indicando que el método de sumersión no entrega de manera efectiva el dsRNA..."
"The white shrimp (Litopenaeus vannamei), is a crustacean that during its larval development passes through morphological, ecological and physiological changes, associated with the maturation of motor and metabolic capacity. In arthropods, the enzymatic activity shows variations related to metamorphosis events. The enzymes on which this research focuses are proteases, enzymes responsible for hydrolyzing peptide bonds within proteins, regulating important cellular processes and maintaining cell homeostasis. In particular, this research focuses on the description of the enzymatic activity and genetic expression of the aspartic proteases, β-secretase and cathepsin D along L. vannamei larval development. Samples of 18 larval stages were donated by a local farm from which total soluble proteins and total RNA were extracted using standard techniques. Proteolytic activity was quantified using fluorogenic substrates specific for aspartic proteases, which was verified with assays in the presence of Pepstatin-A inhibitor, specific for aspartic peptidases. The highest cathepsin D activity was detected at naupliar stages, while β-secretase activity peaked at nauplio substage 3. Cathepsin D transcripts were found in all stages with larger expression at nauplio 5, mysis 2 and 3 stages; on the other hand, β-secretase is expressed in much less quantity but constantly throughout the larval development, only postlarva stage 11 showed significantly higher expression. In order to determine the relevance of these enzymes in larval development, RNAi assays were conducted to silence the transcripts of interest. 15 μg / mL dsRNA was supplied directly to the water where the larvae were kept, the effect of RNAi was evaluated by direct observation of changes in the morphology and behavior of the larvae and by qPCR. The specimens showed no changes in survival or behavior, transcripts concentration in the treatments were not significantly different to controls, indicating that the genetic silencing was not achieved using the soaking delivery method. Our results evince that aspartic peptidase activity is present, and fluctuates during the larval development of the species, these variations are possibly associated with processes related to metamorphosis, probably acting as triggers of apoptosis, as described in other arthropods."
Centro de Investigaciones Biológicas del Noroeste, S. C.
2020
Tesis de maestría
Español
ENZIMOLOGIA
Versión aceptada
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Appears in Collections:Tesis de Maestría en Ciencias en Uso, Manejo y Preservación de los Recursos Naturales

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