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PROTEINASAS ASPÁRTICAS DIGESTIVAS DE LAS LANGOSTAS QUELADAS Homarus gammarus Y Homarus americanus: CARACTERIZACIÓN BIOQUÍMICA Y MOLECULAR
Liliana Carolina Rojo Arreola
Fernando Luis García Carreño
Acceso Abierto
Atribución-NoComercial-SinDerivadas
Proteasas; aspárticas; digestivas; langostas; queladas; gammarus; americanus
It is notorious that most of the described proteinases participating in crustacean food digestion belong to the serine proteinases class, being trypsin and chymotrypsin t he most well studied. Here, we report that the digestive juice of clawed lobster shows unique characteristics since it is constituted exclusively by cystein and aspartic proteinases. For the first time, molecular and biochemical tools were used to study an aspartic proteinase implicated in crustacean protein digestion. In the clawed lobsters, the mRNA encoding such aspartic proteinase it is found solely in the mid gut gland tissue and the codified active enzyme is found in the gastric juice, therefore, we isolated the active aspartic proteinase from the gastric juice of American (Homarus americanus) and European (Hornorus gammarus) lobsters by affinity chromatography. The purified enzyme runs as a single band of "50 kDa on SDS-PAGE under reducing conditions. The enzyme was confirmed as cathepsin D by mass mapping, N-terminal, and full length cDNA sequencing. Its digestive function was confirmed, moreover Ets mRNA exclusiveness in midgut gland tissue, the variation pattern in the quantity of the mRNA encoding it when challenged by fasting followed by feeding. The catalytic properties of the purified lobster enzymes were cornpared to those of bovine cathepsin D and found to be different in a number of ways. The lobster enzymes showed a wider range of pH optimum compared to bovine cathepsin D. Temperature dependence of kinetic parameters was evaluated; lobster enzymes show no difference in KM at 4, 10 and 25 'C; bovine enzyrne show a KM dependent on temperature [...]
De manera general se acepta que las serino proteinasas son las principales participantes en la digestión del alimento en los crustáceos, sin embargo en este trabajo se encontró que los componentes proteinolíticos del jugo gástrico de las langostas ame rica na (Homarus americanus) y europea (Homarus gammorus) son cisteíno y aspártico proteinasas exclusivamente. El presente es el primer trabajo en donde se caracteriza bioquímica y molecularmente a una aspártico proteasa participante de la digestión extracelular en crustáceos. En las langostas queladas, el mRNA de esta aspártico proteinasa se expresa exclusivamente en el tejido de la glándula digestiva y la forma activa se encuentra en el jugo gástrico de donde se aisló usando cromatografía de afinidad. En una SDS-PAGE bajo condiciones reductoras la enzima purificada revela una sola banda de "50 kDa. Se confirmó la identidad de esta enzima como catepsina 0 por medio de la secuenciación N-terminal, por espectrometría de masas y del cDNA que la codifica. Se comprobó su función digestiva, pues además de la expresión tejido-especifica, se confirmo, por medio de un análisis de qPCR, que la concentración del mRNA de esta enzima varía a lo largo de un periodo de ayuno y reatimentaci~n. Las propiedades catalíticas de las enzimas aisladas de langostas fueron comparadas con las de la catepsina D bovina y se demostró que son diferentes en muchos aspectos. Las enzimas de las langostas tienen actividad proteinolítica a un rango de pH más amplio comparado con su homólogo bovino tanto para sustratos naturales como sintéticos. También se evaluó la dependencia a la temperatura de los parárnetros cinéticos KM, Vmax y kcat, las enzimas de las langostas no mostraron una diferencia significativa en los valores de KM a las tres temperaturas evaluadas (4, 10 y 25 "C), mientras que la enzima bovina tiene valores de KM dependientes de la temperatura [...]
Centro de Investigaciones Biológicas del Noroeste, S.C.
19-08-2010
Tesis de doctorado
Español
FISIOLOGÍA ANIMAL
Aparece en las colecciones: Tesis de Doctorado en Ciencias en el Uso, Manejo y Preservación de los Recursos Naturales

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